四種常見ELISA方法

1.直接ELISA

將抗原固定于ELISA板上，然后用酶標(biāo)抗體直檢測抗原。

相較于其它類型的ELISA實驗，直接ELISA實驗步驟少，檢測速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反應(yīng)，測定結(jié)果不容易出錯。但是由于直接ELISA的抗原不是特異性固定的，樣本中的靶蛋白及其他雜質(zhì)蛋白都會與ELISA板結(jié)合，實驗背景會比較高。而且直接ELISA每種靶蛋白都需要準(zhǔn)備能夠與其特異性結(jié)合的一抗，實驗不太靈活。另外由于沒有使用二抗，信號沒有被放大，降低了測定的靈敏度。

2.間接ELISA

先將抗原結(jié)合到ELISA板上，隨后分兩步進(jìn)行檢測：首先加入檢測抗體與抗原特異性結(jié)合，隨后加入酶標(biāo)二抗檢測并利用底物顯色。

與直接ELISA相比，間接ELISA用到酶標(biāo)二抗，具有更高的靈敏度，也需要更少的標(biāo)記抗體，更經(jīng)濟(jì)。間接ELISA還提供了更大的靈活性，因為不同的一抗能夠與單一標(biāo)記的二抗一同使用。間接ELISA實驗的缺點是存在交叉反應(yīng)的可能性（酶標(biāo)二抗直接與抗原結(jié)合），可能會增加背景，同時與直接ELISA相比，間接ELISA實驗多了二抗孵育的步驟，實驗周期延長。

3.夾心ELISA

先將捕獲抗體固定于ELISA板孔中，然后加入樣品，接著加入檢測抗體。如果檢測抗體是酶標(biāo)抗體，則可稱為直接夾心ELISA；如果檢測抗體不帶有標(biāo)記，則還需要使用酶標(biāo)二抗與檢測抗體結(jié)合，這種稱為間接夾心ELISA。

夾心ELISA的靈敏度高，它比直接或間接ELISA敏感2-5倍；同時夾心ELISA使用兩種特異性抗體與抗原結(jié)合，擁有很高的特異性。另外夾心ELISA能夠通過直接或間接的方式進(jìn)行檢測，靈活性較高。夾心ELISA的缺點是對配對抗體要求很高，如果沒有標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒或者已經(jīng)通過測試的配對抗體，則需要進(jìn)行配對抗體定制并進(jìn)行優(yōu)化，因為降低捕獲抗體與檢測抗體之間的交叉反應(yīng)是非常重要的。

4.競爭ELISA法

預(yù)先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標(biāo)記的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢物是抗原，則待檢抗原與預(yù)先包被在固相載體上的抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體；如果待檢測物是抗體，則待檢抗體就與系統(tǒng)中原有的酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被在固相載體上的抗原。通過洗滌洗掉被競爭結(jié)合的酶標(biāo)抗體，最后加底物顯色。需要注意的是顯色結(jié)果與待檢抗原（或抗體）的量成反比。

競爭ELISA相對以上介紹的三種方法更復(fù)雜一些，但以上三種ELISA類型都適用于競爭ELISA的形式。其主要優(yōu)點在于可檢測不純的樣品，且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性高，但存在整體敏感性和專一性較差的問題。