操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結(jié)果分析 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) 中文名稱：Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：50T|100T 產(chǎn)品貨號：BJ-01X6496 產(chǎn)品背景： 細胞凋亡是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復(fù)、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。 在正常細胞中，磷脂酰絲(PS)只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細胞可以識別翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面的PS 從而將這些程序性死亡的細胞清除，因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應(yīng)，而在細胞壞死的過程中則常常伴隨著炎癥反應(yīng)。 AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉(zhuǎn)到膜外的PS 高親和力特異性結(jié)合。PS 外翻發(fā)生在細胞核破裂，DNA 片段化以及凋亡相關(guān)蛋白出現(xiàn)之前，這使得Annexin V 與PS的結(jié)合成為凋亡早期的一種重要檢測標(biāo)志事件。 檢測原理： 在正常的活細胞中，磷脂酰絲(phosphotidylserine，PS)位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。 Annexin-Ⅴ能與PS 高親和力結(jié)合?？赏ㄟ^細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。用標(biāo)記了PE的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發(fā)生。細胞壞死的過程中也會發(fā)生細胞膜損傷，壞死的細胞會結(jié)合Annexin V-PE。 Annexin V-PE 通常與細胞膜非滲透性核酸熒光染料聯(lián)合使用以檢測凋亡細胞。常用的染料是7-AAD。正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的，核酸染料7-AAD 不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和壞死細胞，7-AAD 能夠透過細胞膜與細胞核結(jié)合呈現(xiàn)紅色。 7-AAD/Annexin V-PE試劑盒將AnnexinⅤ與7-AAD匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區(qū)分開來。壞死細胞可以同時與Annexin V-PE和7-AAD 結(jié)合顯色，而7-AAD 則被排除在活細胞(PE陰性)和早期凋亡細胞(PE陽性)之外。在沒有巨噬細胞的情況下，凋亡的后階段會像細胞壞死一樣發(fā)生整個細胞的解體，從而使凋亡晚期的細胞也同時被PE和7-AAD 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。 儲存條件：染色液2-8℃避光保存；結(jié)合液2-8℃保存；長期不用-20℃保存。 Annexin V-PE染色液避免反復(fù)凍融，凍融2次以上可能會失效。長期保存分裝后-20℃保存。 有效期：一年。 |
細胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備： 1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細胞處理： 1） 復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)方法： 1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復(fù)蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。 Karolinska Institute Polyomavirus（KAPyV）KI多瘤病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Perkinsus olseni奧爾森派琴蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Chrysomya bezziana倍贊氏金蠅探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Mycoplasma mycoides cluster絲狀支原體簇LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Covert Mortality Nodavirus(CMNV)偷死野田村病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Leucocytozoon sabrezis沙氏住白 原蟲探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Staphylococcus hominis人葡萄球LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Semen pharbitidis牽牛子LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Brucella spp.布魯氏桿屬通用LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Cortex acanthopanacis五加皮LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Duck Adenovirus鴨腺病毒LAMP試劑盒（暫停） 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Powassan病毒RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒人β萘(β-naphthol)免疫試劑盒*直銷 豬心鈉肽(ANP)免疫試劑盒*直銷 犬透明質(zhì)酸2(HAase 2)免疫試劑盒進口、分裝 小鼠K1(VK1)免疫試劑盒進口、分裝 綿羊γ干擾素(IFN-γ)免疫試劑盒進口、組裝 小鼠二肽基肽Ⅳ(DPPⅣ)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng) 大鼠粘膠蛋白/肌腱蛋白C(TN-C)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng) 兔子神經(jīng)肽P(NP-P)免疫試劑盒進口、分裝 大鼠化腺苷酸活化蛋白激(pAMPK)免疫試劑盒*直銷 人脂肪甘油三酯脂(ATGL)免疫試劑盒進口、組裝 大鼠白介素1β(IL-1β)免疫試劑盒進口、組裝
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