特點(diǎn): 1. 即開即用,用戶只需要提供病毒樣品。 2. 根據(jù)瑞氏絳蟲通用保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物,與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。 3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。 4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè),避免后續(xù)污染。 5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。 6. 本產(chǎn)品只適用于科研,不能用于臨床診斷。 儲(chǔ)存條件:-20℃以下,有效期12個(gè)月。 產(chǎn)品名稱 | 瑞氏絳蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒 | 英文名稱 | Raillietina spp. | 貨號(hào) | BJ-R7130 |
實(shí)驗(yàn)過程: 一、試劑準(zhǔn)備 1. DNA模板 2.對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物(在PCR反應(yīng)中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此,擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物) 3.10×PCR Buffer 4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5.Taq酶 二、操作步驟 1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5μl dNTP mixl 4μl 引物1(10pM) 2μl 引物2(10PM) 2μl Taq酶(2U/μl) 1μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。 2.調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴(kuò)增。一般:在93℃預(yù)變性3-5min,進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。 3.結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。 4.PCR的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測(cè)。 三、注意事項(xiàng) 1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。 2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結(jié)果,純化的方法越簡(jiǎn)單越好。 3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。 4.PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水,采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。 5.試劑都應(yīng)該以大體積配制,試驗(yàn)一下是否滿意,然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存,從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。 6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。 7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開,并且要充分混勻。 使用方法: 一、樣品采集: 1、食品樣品:樣品的采集與預(yù)培養(yǎng)按照樣品的采集與預(yù)培養(yǎng)按照菌檢驗(yàn)要求進(jìn)行。 2、血液樣品:用無菌注射器抽取受檢者靜脈血2mL,注入無菌EDTA2Na(或檸檬酸鈉)抗凝管,立即混勻。 3、糞便樣品:取糞便置于滅菌的收集管中送檢。 4、病灶部位樣品:取發(fā)病部位新鮮滲出物、粘液膿血送檢。 一、稀釋 PCR 陽性對(duì)照(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例) 1. 注意:由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照,只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。 2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。 3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液(用帶芯槍頭,下同)。 4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照,充分震蕩 1 分鐘,得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。 5. 換槍頭,在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用 6. 換槍頭,在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照到 5 號(hào)管中,充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對(duì)照。放冰上待用。 7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。 原理: 所謂實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。 檢測(cè)方法 1.SYBRGreenⅠ法: 在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號(hào),而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào),從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。 SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖 PCR產(chǎn)物熔解曲線圖 2.TaqMan探針法: 探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物的形成*同步。 弱性深蘭5R英文名稱:Weak acid deep blue 5R分子式:分子量:: 丙二乙英文名稱:Propylene glycol ether分子式:104.15分子量: C5H12O2:1569-02-4 3-吡咯啉分子式:69.11英文名稱:3- the:109-96-6分子量: C4H7N 1,3-二噻烷-2-甲乙酯英文名稱:1,3- two -2- ethyl formate分子式:192.3分子量: CB6490333:20462-00-4 地米還原物英文名稱:Ground rice reduction分子式:420.47分子量: C23H29FO6:7793-38-6 4-溴-2-氟甲分子式:189.02英文名稱:4- -2- fluoride:51436-99-8分子量: C7H6BrF 炔草英文名稱:Oxalic acid分子式:349.74分子量: C17H13ClFNO4:105512-06-9 伏蟲隆英文名稱:Volt worm分子式:381.1分子量: C14H6CL2F4N2O2:83121-18-0 托曲珠利英文名稱:Toltrazuril分子式:425.38分子量: C18H14F3N3O4S:69004-03-1 固藍(lán)RR英文名稱:Solid blue RR salt分子式:387.89分子量: C 15 H 14 ClN 3 O 3 · 1:14726-29-5 2,4,6-*吡分子式:121.18英文名稱:2,4,6- three methyl pyridine:108-75-8分子量: C8H11N 瑞氏絳蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒MV3(人色素瘤細(xì)胞)5×106cells/瓶×2 香菇 Lentinula edodes人食管平滑肌細(xì)胞*培養(yǎng)基 TEMED中慢生華癸瘤菌 Mesorhizobium huakuii TE-11(人食管細(xì)胞)5×106cells/瓶×2 靈芝 Ganoderma lucidium L6(大鼠成肌細(xì)胞)U-118 MG(人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤) V-Rel網(wǎng)狀內(nèi)皮增生病毒基因同源物A(RELA)重組蛋白英文名稱:Recombinant V-Rel Reticuloendotheliosis Viral Oncogene Homolog A (RELA) Campy-Cefex添加劑/Campy-Cefex Supplement添加于200ml CAMPY-CEFEX瓊脂基礎(chǔ)中2毫升×10支國(guó)產(chǎn)/進(jìn)口 李氏增菌LB1凍干配套試劑 規(guī)格: 10支 用途: 每支添加于225ml(026040)中配成LB1增菌。 22RV1(人前列腺細(xì)胞)5×106cells/瓶×2 苜蓿中華瘤菌 Sinorhizobium meliloti三苯甲基硝胺梭菌 Clostridium tetryl |