操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。 7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。 8、結(jié)果分析 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) 中文名稱：PCNA細胞增殖檢測試劑盒(ICF/FACS法) 英文名稱：PCNA cell proliferation Detection Kit 產(chǎn)品規(guī)格：20T 產(chǎn)品貨號：BJ-01X6405 PCNA 細胞增殖檢測試劑盒（細胞免疫熒光法/流式細胞儀檢測），PCNA是細胞DNA 多聚酶的“δ"輔助蛋白，是真核細胞DNA 合成時所必需的一種酸性核蛋白。PCNA 在細胞核內(nèi)合成，并儲存在核內(nèi)，細胞處于靜止狀態(tài)時，其含量很低，當細胞進入增殖周期中，其表達明顯增加，故PCNA 的表達高低可反映細胞增殖的活躍程度。 操作方法 1. 在適的環(huán)境下培養(yǎng)細胞。 2. 除去培養(yǎng)液，用PBS 洗一次。 3. 處理和收集細胞，離心，（注意1）保證每管細胞數(shù)在106 個。 4. 用0.3 ml PBS 輕輕的重懸細胞, 然后慢慢加入0.7 ml 預冷的100%乙醇。用1 ml 玻璃移液管小心的混勻。在4°C 至少1h。（注意2） 5. 沉淀細胞，*吸去上清。 6. 用150 μl PBS/1 % BSA 洗細胞2 次。 7. 用100μl 抗體孵育液（0.5% Tween-20/1%BSA/PBS）重懸細胞，加入1ul PCNA 抗體(1μg/106 cells)，室溫孵育1 小時。 8. 離心收集細胞，用150μl1% BSA-PBS 洗2 次。 9. 離心收集細胞，用50μl 抗體孵育液重懸，加1μl (1.5μg/106 cells) 羊抗鼠IgG-FITC，室溫孵育30 分鐘。離心收集細胞，150μl PBS/ 1 % BSA 洗2 次。 10. 用含有終濃度為10 μg/ml RNase A 和20μg/ml PI 的0.5 ml PBS（pH7.4）重懸細胞。 11. 避光使細胞在室溫下孵育20min 后，離心收集細胞，150μl PBS/ 1 % BSA 洗2 次后，轉(zhuǎn)移至流式檢測管中重懸。 12. FACS 檢測或者儲存于4℃。 |
細胞培養(yǎng)操作規(guī)程： 一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備： 1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。 2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。 二． 細胞處理： 1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
細胞培養(yǎng)方法： 1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次； ②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化； ③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止； ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清； ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基； ⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復蘇： ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶） ②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化； ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞； ④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。 安康魚源性成分PCR試劑盒 種源性檢測/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Semen strychni馬錢子探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 山羊源性成分染料法熒光定量PCR試劑盒 種源性檢測/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Radix polygalae遠志探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Ebola Virus(EBOV)埃博拉病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Trypanosoma congolense剛果錐蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Oesophagostomum clumbianum克氏食道線蟲探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Histoplasma capsulatum var. farciminosum莢膜組織胞漿馬皮疽變種LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Radix stellariae銀柴胡探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Mycobacterium szulgai斯氏分枝桿探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Allpaahuayo virus(ALLV)奧爾帕瓦約病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Flexal Virus(FLEV)弗萊克索病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 PCNA細胞增殖檢測試劑盒(ICF/FACS法)0.1%呂氏堿性美藍染色液 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：5ml*6支/盒 MYC蛋白免疫共沉淀分析試劑盒 5次 細胞脯氨酰肽（prolinase）比色法定量檢測試劑盒 20次 GST融合蛋白甘肽樹脂再生試劑盒 20次 植物甘露糖6-異構（mannose－6－phosphate isomerase；MPI）電泳分析試劑盒 5次 組織FGR激活性定量檢測試劑盒（A/B/C） 20次 RyR受體蛋白表達西方雜交分析試劑盒 5次 細胞熒光素活性化學發(fā)光法定量檢測試劑盒 20次 冰凍切片半胱蛋白-2（CASPASE-2）活性原位熒光染色檢測試劑盒 50次 血栓素B2（TXB2）高效液相色譜法定量檢測試劑盒 20次 細胞CYP1A2蛋白表達流式細胞儀檢測試劑盒 10/20次
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