細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱：VEGFR抑制劑(ZM 306416)

英文名稱：ZM 306416

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|10mg|50mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8603

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

人 UBE2S 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽VEGF蛋白免疫共沉淀分析試劑盒  5次

人 COPS8 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽VEGF蛋白表達(dá)ELISA定量檢測試劑盒  25次

人 ATF6 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)胞BAD蛋白表達(dá)流式細(xì)胞儀檢測試劑盒  10/20次

人 AP3S2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽載玻片細(xì)胞BAD蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 APOBEC3C 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽冰凍切片組織BAD蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 N6AMT1 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽石蠟切片組織BAD蛋白表達(dá)熒光顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 AP1S1 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽載玻片細(xì)胞BAD蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 CLDN15 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽冰凍切片組織BAD蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 APOA2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽石蠟切片組織BAD蛋白表達(dá)NBT顯色光學(xué)顯微鏡檢測試劑盒  10/20次

人 USP33 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)胞BAD蛋白表達(dá)比色法定量檢測試劑盒  10/50 次

人 WWP2 基因全長ORF克隆 (表達(dá)載體), 無標(biāo)簽細(xì)胞BAD蛋白表達(dá)熒光定量檢測試劑盒  10/50 次

VEGFR抑制劑(ZM 306416)Donkey Anti-Goat IgG/RBITC  羅丹明標(biāo)記的驢抗羊IgG 規(guī)格: 0.1ml

Transferrin(1F10)  轉(zhuǎn)鐵蛋白單克隆抗體 規(guī)格: 0.1ml

AEV(Avian Encephalomyelitis virus)  禽腦脊髓毒AEV抗體 0.1ml

Phospho-c-Kit(Tyr721)  磷酸化原基因c-kit抗體 規(guī)格: 0.1ml

VANGL1/LPP2  瘤抑制基因LPP2抗體 規(guī)格: 0.2mlPCDHA5  原鈣粘附蛋白α5抗體 規(guī)格: 0.2ml

Cripto 1 monoclonal  畸胎瘤衍化生因子單克隆抗體 規(guī)格: 0.2ml

IQCC  IQCC蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

DECR1  線粒體2,4-雙烯酰輔A還原1抗體 規(guī)格: 0.1ml

VAT  囊泡乙酰通道抗體 規(guī)格: 0.1ml

DAAM1  形態(tài)發(fā)生紊亂關(guān)聯(lián)激活因子1抗體 規(guī)格: 0.1mlKappa Light Chain  k輕鏈抗體 規(guī)格: 0.1ml

Lamin B [Nuclear Envelope Marker]  核纖層蛋白B抗體(細(xì)胞核內(nèi)參) 規(guī)格: 0.1ml