操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細(xì)胞，細(xì)胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：PI3K/mTOR雙重抑制劑（PKI-402）

英文名稱：PKI-402

產(chǎn)品規(guī)格：5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8312

細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時進行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

小鼠 IL4 基因全長ORF克隆雞透明質(zhì)酸(HA)免疫試劑盒進口、組裝

小鼠 SRPK2 基因全長ORF克隆雞銅藍蛋白(CP)免疫試劑盒進口、分裝

小鼠 MBIP 基因全長ORF克隆雞天門冬氨基轉(zhuǎn)移(AST)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

小鼠 ROBO4 基因全長ORF克隆雞糖皮質(zhì)激素(GC)免疫試劑盒*直銷

小鼠 PKC nu / PRKD3 基因全長ORF克隆雞酐(CA)免疫試劑盒進口、組裝

小鼠 FURIN 基因全長ORF克隆雞髓磷脂堿性蛋白(MBP)免疫試劑盒進口、分裝

小鼠 Rspo2 基因全長ORF克隆雞瘦素(LEP)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

小鼠 MAPK10 基因全長ORF克隆雞生長激素(GH)免疫試劑盒*直銷

小鼠 OCRL 基因全長ORF克隆雞腎素(Renin)免疫試劑盒進口、組裝

小鼠 GP1bb 基因全長ORF克隆雞腎上腺髓質(zhì)素(ADM)免疫試劑盒進口、分裝

小鼠 FLRT2 基因全長ORF克隆雞腎上腺素(EPI)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

PI3K/mTOR雙重抑制劑（PKI-402）土壤纖維素酶(S-CL)/羧甲基纖維素酶測試盒(可見分光光度法)  50管/24樣  酪蛋白葡萄糖肉湯 Sabouraud-dextrose Broth 250g

土壤過氧化氫酶(S-CAT)測試盒(微量法)  100管/48樣  1g 對鈉鹽 p-Nitrophenylphosphate Disodium Salt Hexahydrate（p-NPP） -20℃保存

土壤過氧化氫酶(S-CAT)測試盒(紫外分光光度法)  50管/24樣  我妻氏培養(yǎng)基基礎(chǔ) Wagstsuma Agar Base 250g

土壤硝酸還原酶(S-NR)測試盒(微量法)  100管/48樣  5 mg JC-10 Fluorescent Probe and Tracer -20℃保存

土壤硝酸還原酶(S-NR)測試盒(可見分光光度法)  50管/24樣  50mL Calcium Chloride Solution（氯化鈣溶液）, 1M Calcium Chloride Solution, 1M 常溫保存

土壤蔗糖酶(S-SC)測試盒(微量法)  100管/48樣  50次 柱式OLIGO回收試劑盒 Column OLIGOBACK 4℃保存

土壤蔗糖酶(S-SC)測試盒(可見分光光度法)  50管/24樣  2 ug pGL4.28[luc2CP/minP/Hygro] pGL4.28[luc2CP/minP/Hygro] 低溫運輸，-20℃保存

土壤汞(S-Hg)濃度測試盒(微量法)  100管/96樣  改良羅氏培養(yǎng)基基礎(chǔ) L-G medium Base,Modified 250g

土壤汞(S-Hg)濃度測試盒(可見分光光度法)  50管/48樣  1瓶 hFOB 1.19細(xì)胞株 hFOB 1.19 低溫運輸和保存

土壤總磷/有機磷/無機磷含量測試盒(微量法)  100管/96樣  胰酪胨大肉湯 Trypticase-Soy-Polymyxin Broth Base 10ml/支*20

土壤酸性磷酸酶(S-ACP)測試盒(微量法)  100管/96樣  250mg  Pepsin  4℃保存