細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1） 準(zhǔn)備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2） 細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

中文名稱(chēng)：HER2二聚抑制劑(Pertuzumab)

英文名稱(chēng)：Pertuzumab

產(chǎn)品規(guī)格：1mg|5mg

產(chǎn)品貨號(hào)：BJ-01X8557

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細(xì)胞100μL/孔，通常細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升2000個(gè)細(xì)胞，細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)每孔加入100微升5000～10000個(gè)細(xì)胞（具體每孔所用的細(xì)胞的數(shù)目，需根據(jù)細(xì)胞的大小，細(xì)胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí).

2、.加入適當(dāng)濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)時(shí)間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時(shí)，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標(biāo)儀在570nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度（如無(wú)570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細(xì)胞的存活率：將各測(cè)試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無(wú)細(xì)胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無(wú)細(xì)胞），各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細(xì)胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細(xì)胞的OD 值，C 為對(duì)照細(xì)胞的OD 值。細(xì)胞存活率% =（加藥細(xì)胞OD/對(duì)照細(xì)胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時(shí)的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時(shí)的藥物濃度(IC90)

甲型流感 H5N1 (Anhui/1/2005) 神經(jīng) (Neuraminidase / NA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽純化線(xiàn)粒體ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H2N2 (Japan/305/1957) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽細(xì)胞ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H1N1 (California/07/2009) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽組織ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H5N1 (turkey/Turkey/1/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽ATP生物發(fā)光法細(xì)胞繁殖與毒性定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H5N1 (bar-headed goose/Qinghai/6/2008) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽細(xì)ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H1N1 (California/04/2009) 神經(jīng) (Neuraminidase / NA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽真/酵母ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H3N2 (Brisbane/10/2007) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽植物ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H1N1 (Brisbane/59/2007,2008-2009) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽食物污染ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

甲型流感 H5N1 (Anhui/1/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽飲料污染ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

GFP 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 帶His標(biāo)簽水質(zhì)污染ATP生物發(fā)光法定量檢測(cè)試劑盒  50次

GFP 基因全長(zhǎng)ORF克隆 (密碼子優(yōu)化)(表達(dá)載體), 無(wú)標(biāo)簽動(dòng)物細(xì)胞趨化作用（chemotaxis）軟瓊脂檢測(cè)試劑盒  10次

HER2二聚抑制劑(Pertuzumab)OTOA/DFNB22  耳聾、常染色體隱性遺傳22抗體 規(guī)格: 0.2ml

Megsin  絲蛋白抑制劑B7抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mouse Anti-Guinea pig IgG/Cy7  Cy7標(biāo)記的小鼠抗豚鼠IgG 規(guī)格: 0.1mlMouse Anti-Rabbit IgM/Cy5.5  Cy5.5標(biāo)記的小鼠抗兔IgM 規(guī)格: 0.1ml

LDOC1/BCUR1  癥亮拉鏈下調(diào)因子1抗體 規(guī)格: 0.2mlC17orf53  17號(hào)染色體開(kāi)放閱讀框53抗體 規(guī)格: 0.2ml

ETFA  電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白α抗體 0.2ml

IQCG  IQCG蛋白抗體 規(guī)格: 0.2mlSOSSC/C9orf80  單鏈DNA結(jié)合蛋白相互作用蛋白1 規(guī)格: 0.2ml

FGFR1OP/FOP  成纖維細(xì)胞生因子受體1原基因伴侶蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Fascin/Actin bundling protein  肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白Fascin抗體 規(guī)格: 0.2ml

phospho-P53(Ser33)  磷酸化瘤抑制基因P53抗體 規(guī)格: 0.1ml

SorLA/LRP9  脂蛋白受體相關(guān)蛋白9抗體 規(guī)格: 0.2ml

CD1A  T淋巴細(xì)胞CD1A抗體 規(guī)格: 0.1mlPhospho-HER3 (Tyr1197)  磷酸化HER3受體抗體 規(guī)格: 0.1ml