操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：BRAF(V600E/WT)和c-Raf抑制劑（CEP-32496）

英文名稱：CEP-32496

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X8084

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉入液氮罐儲存。

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BRAF(V600E/WT)和c-Raf抑制劑（CEP-32496）HIV整合酶抑制劑(BMS-538203)  1mL(10mM)|5mg|10mg|50mg|100mg  BMS-53820310mg 5′ - 二鳥 Guanosine 5′-Diphosphate (GDP),Disodium Salt -20℃保存

核糖核苷酸還原酶抑制劑(Osalmid)  1mL(10mM)|100mg|500mg|1g  Osalmid50T 芥末PCR檢測試劑盒  低溫運輸，-20℃保存

cGMP依賴蛋白激酶抑制劑(MBP146-78)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg  MBP146-78250mL Carnoy固定液 Carnoy Solution 室溫避光保存

胞內(nèi)分枝桿菌抑制劑(BM212)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg  BM2122 ug pBlueScriptR BBS4 pBlueScriptR BBS4 低溫運輸，-20℃保存

arenavirus抑制劑(ST-193)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg  ST-193100g DNGuSCN（異硫酸胍）  

HIV-1逆轉錄抑制劑(Trovirdine)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|25mg|50mg  Trovirdine2 ug pFUGW-H1 pFUGW-H1 低溫運輸，-20℃保存

β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（Potassium clavulanate cellulose）  10mg|50mg|100mg|200mg|500mg  Potassium clavulanate cellulose碘液  2ml*20支

LeuRS抑制劑（Epetraborole hydrochloride）  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg|100mg  Epetraborole hydrochloride2 ug pTf16 pTf16 低溫運輸，-20℃保存

小分子核糖體拯救抑制劑(KKL-10)  1mL(10mM)|1mg|5mg|10mg|50mg  KKL-10MUGal肉湯 MUGal Broth 100g

外排泵抑制劑(PAβN dihydrochloride)  1mL(10mM)|5mg|10mg|25mg|50mg|100mg|250mg  PAβN dihydrochloride100U Poly（A）聚合，E.coli Poly(A) Polymerase -20℃保存

GFP表達抑制劑(Ribocil)  1mL(10mM)|2mg|5mg|10mg|50mg|100mg  Ribocil250mL Phosphate Buffered RIPA  Phosphate Buffered RIPA  常溫保存