細胞培養(yǎng)操作規(guī)程: 一.培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備: 1) 準備F-12K培養(yǎng)基;優(yōu)質(zhì)胎牛血清,10%;雙抗,1%。 2) 培養(yǎng)條件: 氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。 溫度:37℃,培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。 3) 凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配。 二. 細胞處理: 1) 復(fù)蘇細胞:將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中(水面要低于凍存管蓋部)搖晃解凍,移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。 2) 細胞傳代:如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養(yǎng)。 中文名稱:膠原酶III型 英文名稱:Collagenase III 產(chǎn)品規(guī)格:100mg 產(chǎn)品貨號:BJ-01X6551 本品為III型膠原酶,≥100 U/mg solid,常用于乳腺細胞和胎兒細胞的制備。 本品來源于溶組織梭菌(Clostridium histolyticum),是一種酶粗提物,不僅含有膠原酶(更準確的稱法為梭菌蛋白酶A(clostridiopeptidase A)),能夠降解天然膠原和網(wǎng)狀纖維。還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等,分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白,多糖和脂質(zhì),使得本品非常適用于組織消化。 膠原酶(Collagenase)是一種蛋白酶,一種肽鏈內(nèi)切酶,能夠特異性的識別Pro-X-Gly-Pro序列(該序列高頻率出現(xiàn)在膠原中,很少發(fā)現(xiàn)于其他蛋白中)并切割該序列中性氨基酸(X)和甘(Gly)之間的肽鍵。許多蛋白酶都能水解單鏈且變性的膠原多肽,但膠原酶是一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶,這種膠原纖維廣泛存在結(jié)締組織內(nèi)。 目前商業(yè)化提供的細菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異,分為四種類型:膠原酶I型,II型,III型和IV型,在應(yīng)用上有所偏向: 1)膠原酶I(Type I Collagenase):含有比較均勻的各種酶活力(包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、活性)。通常用作上皮細胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細胞的制備; 2)膠原酶II(Type II Collagenase):含有更高的梭菌蛋白酶活性,通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細胞的制備; 3)膠原酶III(Type III Collagenase):含有較低的蛋白酶活性,常用于乳腺細胞的制備; 4)膠原酶IV(Type IV Collagenase):含有低活性,通常用于胰島細胞的制備,或者需要維持受體完整性的細胞制備實驗。 分子量:68-130 kDa 激活劑:Ca2+、Zn2+ 抑制劑:EDTA, EGTA,Cysteine, histidine, 2-mercaptoethanol, o-phenanthroline DTT, Hg2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Not inhibited by DFP or serum 活力單位:在37℃,pH7.5 的條件下,5h內(nèi)水解膠原產(chǎn)生相當于1μM L-亮的酶量定義為1個酶活力單位。 儲存條件:4℃避光,有效期兩年 |
細胞培養(yǎng)方法: 1、細胞傳代:細胞密度達到80-90%時即可傳代 ①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次; ②加入2ml0.25%(T25瓶),使覆蓋整個瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化; ③1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化;若細胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止; ④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清; ⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基; ⑥懸浮細胞直接離心收集,細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。 2、細胞復(fù)蘇: ①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。 ②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補加適量培養(yǎng)基。 3、細胞凍存:待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種 ①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%(T25瓶) ②1-2min后,顯微鏡下觀察細胞,大部分細胞回縮且有少量細胞脫落,輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化; ③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細胞; ④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。 操作規(guī)程 1、在96孔板加入細胞100μL/孔,通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞,細胞毒性實驗每孔加入100微升5000~10000個細胞(具體每孔所用的細胞的數(shù)目,需根據(jù)細胞的大小,細胞增殖速度的快慢等決定)。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時. 2、.加入適當濃度的0~10μL 受試化合物。 3、將96孔板在37℃,含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。 4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。 5、每孔加50μL 1× MTT 溶液,在37℃孵育4小時,使MTT 還原為甲臜。 6、吸出上清液,每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解,用平板搖床搖勻。 7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度(如無570nm 濾光片,可以使用560-600nm 的濾光片)。 8、結(jié)果分析 a、細胞的存活率:將各測試孔的OD 值減去本底OD 值(*培養(yǎng)基加MTT,無細胞)或空白藥物孔OD 值(*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT,無細胞),各重復(fù)孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示,T 為加藥細胞的OD 值,C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100 b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90) Brucella spp.布魯氏桿屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Equine Coronavirus(ECoV)馬RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Pneumocystis carinii卡氏肺孢子蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 B Virus(BV)B皰疹病毒LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 St.Louis Encephalitis Virus(SLEV)圣路易斯腦炎病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Border Disease Virus(BDV)羊邊界病病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Maedi-Visna Virus(MVV)梅迪-維斯納病病毒探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Leishmania infantum嬰兒利什曼蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Ehrlichia canis犬艾利希體(犬埃立克體)PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用) 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Arcanobacterium haemolyticum溶血隱秘桿染料法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Radix sophorae tonkinensis山豆根探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Eikenella corrodens嚙蝕艾肯LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測(科研用)/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 膠原酶III型豬口蹄疫抗體(IgG)免疫試劑盒進口、組裝 犬促甲狀腺素(TSH)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng) 小鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(NRG1)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng) 雞腫瘤壞死因子α(TNF-α)免疫試劑盒進口、組裝 小鼠百日咳病毒IgG抗體免疫試劑盒*直銷 大鼠血小板衍生生長因子A(PDGF-A)免疫試劑盒*直銷 兔子補體蛋白5(C5)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng) 大鼠金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(MTP1)免疫試劑盒進口、組裝 人異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A0(hnRNP A0)免疫試劑盒進口、分裝 大鼠L-乳酸脫氫(L-LDH) 免疫試劑盒進口、分裝 人嗜酸性粒細胞陽離子蛋白(ECP)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)
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