操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 時的藥物濃度(IC50)及T/C = 10%時的藥物濃度(IC90)

中文名稱：VEGFR抑制劑(Axitinib)

英文名稱：Axitinib

產(chǎn)品規(guī)格：1mL(10mM)|50mg|100mg|200mg|500mg

產(chǎn)品貨號：BJ-01X7459

細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1） 準備F-12K培養(yǎng)基；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；雙抗，1%。

2） 培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。

二． 細胞處理：

1） 復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入*培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

Eurytrema coelomaticum腔闊盤吸蟲LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周HIST1H2AH  組蛋白H2A/S抗體 規(guī)格: 0.2ml

Influenza Virus B 乙型流感病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周phospho-GCN2 (Thr667)  磷酸化蛋白激GCN2蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

Thallus laminariae昆布LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周Phospho-GCN2 (Thr899)  磷酸化蛋白激GCN2蛋白抗體 規(guī)格: 0.1mlGoat Anti-Mouse IgM/Cy3  Cy3標記的羊抗小鼠IgM 規(guī)格: 0.1ml

Avian Encephalomyelitis Virus(AEV)禽腦脊髓炎病毒RT-LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周LDOC1/BCUR1  癥亮拉鏈下調(diào)因子1抗體 規(guī)格: 0.2mlC17orf53  17號染色體開放閱讀框53抗體 規(guī)格: 0.2ml

Mycoplasma spp.支原體通用探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 1-2周Rabbit Anti-Mink IgG/Alexa Fluor 350  Alexa Fluor 350標記的兔抗水貂IgG 規(guī)格: 0.1mlMIIP  IGFBP2結(jié)合蛋白/遷移和侵潤抑制蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

Ceratitis capitata地中海實蠅PCR試劑盒 植物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周BCAR1  抗雌激素耐藥蛋白1 規(guī)格: 0.2mlGYG1  糖原蛋白1抗體 規(guī)格: 0.2ml

大豆源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒 種源性檢測/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周Phospho-BRCA1(Ser988)  磷酸化易基因1抗體 規(guī)格: 0.1mlphospho-c-Jun(Thr91+Thr93)  磷酸化原基因c-Jun抗體 規(guī)格: 0.1ml

Acinetobacter spp.不動桿屬通用探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周Phospho-PAK4(Ser474)/PAK5(Ser602)/PAK6(Ser560)  磷酸化p21激活激4/5/6抗體 規(guī)格: 0.1mlPlexin A1  神經(jīng)叢蛋白A1抗體 規(guī)格: 0.2ml

Kobuvirus嵴病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周IL-15RA  白介素15受體α抗體 規(guī)格: 0.2mlLCEAH/ECHS1  鏈烯脂酰輔A水化抗體 規(guī)格: 0.1ml

Feline Calicivirus(FCV)貓杯狀病毒前病毒LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周phospho-AXL (Tyr698+Tyr702+Tyr703)  磷酸化粘附相關(guān)激抗體 規(guī)格: 0.1mlPhospho-Beta-Catenin (Ser552)  磷酸化β 連環(huán)素蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

VEGFR抑制劑(Axitinib)Na+-Ca2+exchanger抑制劑（SEA0400）

Factor Xa抑制劑(Apixaban)

DPP4抑制劑(Sitagliptin)

FXa抑制劑（Rivaroxaban）

Ang-(1-7)激動劑(AVE 0991)

ACE抑制劑(Angiotensin 1-7)

HMG-CoA reductase抑制劑

beta adrenergic receptor激動劑（Isoprenaline hydrochloride）

NOX1/4抑制劑（GKT137831）

HMG-CoA還原酶抑制劑(Lovastatin)

myosin II抑制劑（(-)-Blebbistatin）