產(chǎn)品參數(shù)： 中文名稱 | 英文名稱 | 產(chǎn)品規(guī)格 | 產(chǎn)品貨號 | Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測試劑盒 | Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit | 50次 | BJ-01X6356 |
商品詳細介紹： 本試劑盒是一種采用Annexin-PE與7-AAD雙染法進行細胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。 細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲(PS)從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性，對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就被破壞。7-AAD是一種核酸染料，可進入死細胞內(nèi)與DNA結(jié)合，能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募毎M行染色。7-ADD與PI有著相似的熒光特性，但其發(fā)射波譜較PI窄，對其他檢測通道的干擾更小，在多色熒光分析中是PI的佳替代品，因此通常將Annexin V-PE與ADD配合染色，以區(qū)別凋亡早期細胞與壞死細胞和凋亡的晚期細胞。 操作步驟： 1、細胞樣品的準備： a．對于貼壁細胞：小心收集細胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用消化細胞，至細胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細胞，并輕輕吹散細胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞，小心吸除上清。再次加入1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。 b．對于懸浮細胞：1000×g左右離心3-5分鐘，沉淀細胞。對于特定的細胞，如果細胞沉淀不充分，可以適當延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細胞。加入約1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，并轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細胞，小心吸除上清，可以殘留約50μl左右的PBS，以避免吸走細胞。再次加入1ml 4℃預冷的PBS，重懸細胞，再次離心沉淀細胞。 2、用去離子水按1:3稀釋Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml去離子水)。 3、用250μl Binding Buffer重新懸浮細胞，調(diào)節(jié)其濃度為1×106/ml。 4、取 100μl 的細胞懸液于 5ml 流式管中，加入 5μl Annexin V-PE 和 10μl 7-AAD 溶液。 5、混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘。 6、在反應管中加400μl PBS，流式細胞儀(FACS)分析。 Jurkat細胞用誘導凋亡后用Annexin V-PE/7AAD雙染流式分析圖譜 儲存條件：2～8℃，避光保存 |
實驗報告： 一、分離與培養(yǎng)： 1、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織，然后用PBS將此組織塊清洗2次，最后將組織剪成1mm3左右大??； 2、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型膠原酶），混懸10s，置37℃條件下消化10min，之后用滴管吹打制成單細胞懸液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置； 3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液，混懸10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置，重復此步驟2-3次，直至組織*被消化； 4、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細胞消化液，1200r/min 離心10min，棄去上清，沉淀細胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； 5、差速貼壁1h后，吸出培養(yǎng)基，按實驗需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)； 二、免疫熒光鑒定： 1、待心房肌細胞生長至80%融合時，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細胞15min； 2、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在4℃條件下，用0.1％Triton X-100透膜15min； 3、PBS沖洗細胞2次，每次10min，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細胞30min； 4、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細胞過夜； 5、PBS沖洗細胞3次，每次10min，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗， 37℃條件下放置1h； 6、用PBS沖洗3次，每次10min，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照。 培養(yǎng)操作步驟 ： 1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布； 2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）； 3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時； 4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片*浸在培養(yǎng)液中； 5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及免疫細胞化學檢測。
 實驗要點及說明： 1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法； 2．所使用的蓋玻片應該為優(yōu)質(zhì)玻璃，并經(jīng)過鉻酸洗液處理； 3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕； 4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率； 5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。 操作要點： 1）將培養(yǎng)基在37℃水浴鍋預熱；準備一個15mL無菌的離心管，加入8mL預熱培養(yǎng)基。 2）將凍存細胞從液氮罐中取出，快速放入37℃水浴鍋中復溫（可準備一潔凈的燒杯，裝滿37℃的水，細胞凍存管取出后迅速放入燒杯內(nèi)，再逐步轉(zhuǎn)移到水浴鍋中）。輕輕晃動凍存管，使細胞能在1~2min內(nèi)*解凍，使細胞能盡快通過最易受損的溫度段（-5~0℃）。注意凍存管管口不能沒入水中，BRL(大鼠肝細胞)避免引起污染。 3）用75%酒精擦拭凍存管后再置于超凈臺內(nèi)，將管內(nèi)細胞轉(zhuǎn)移至準備好的離心管內(nèi)，輕輕吹打液體，使細胞均勻分散，降低DMSO濃度，吹打時避免產(chǎn)生氣泡。用新鮮培養(yǎng)基洗管壁2次，均轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)。 4）800rpm離心5min，棄上清，加入新鮮的培養(yǎng)基，吹打制成細胞懸液。 5）將細胞懸液轉(zhuǎn)移至T25細胞瓶內(nèi)，補加適量的培養(yǎng)基，輕輕晃動細胞瓶使細胞分布均勻，放入溫箱內(nèi)培養(yǎng)。 6）第二天觀察細胞貼壁生長情況，換新鮮培養(yǎng)基以去除死細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞長至80~90%匯合時正常傳代。一般剛復蘇的細胞需經(jīng)過2~3次傳代，細胞活力恢復后才能進行后續(xù)的實驗。 Radix isatidisLAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Hepatitis B Virus(HBV)乙型肝炎病毒H型探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Phialophora malorum蘋果邊腐病PCR試劑盒 植物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Moraxella catarrhalis卡他莫拉探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Bulbus fritillariae cirrhosae川貝母LAMP鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Human Immunodeficiency Virus 1(HIV-1)人免疫缺陷病毒I型通用探針法熒光定量RT-PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Providencia stuarti斯氏普羅威登斯探針法熒光定量PCR試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Peronosclerospora spp.玉米霜霉病PCR試劑盒 植物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 甲型流感/乙型流感雙重染料法熒光定量PCR試劑盒 定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Agkistrodon蘄蛇染料法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Human Herpesvirus-8(HHV-8)人皰疹病毒8型LAMP試劑盒 動物病原微生物檢測（科研用）/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-3周 Ramulus mori桑枝探針法PCR鑒定試劑盒 中藥材鑒定試劑盒/定做種屬檢測試劑盒 50次 低溫 負20度 一年 2-4周 Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式檢測試劑盒組織PKCζ激活性定量檢測試劑盒（A/B/C） 20次 細糖酵解溴百里藍（BTB）檢測試劑盒 20次 冰凍切片組織P27蛋白表達NBT顯色光學顯微鏡檢測試劑盒 10/20次 [γ32P]ATP激標記試劑盒 20次 脂質(zhì)過氧化物異構(gòu)前列腺素（ISOPROSTANE）ELISA定量測定試劑盒 48/96次 電子顯微鏡制片處理試劑專題 組織二酯1（PDE1）活性連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑盒 10次 細胞/組織線粒體DNA萃取試劑盒 10次 組織總抗氧化能力（TAC）比色法（DDPH）定量檢測試劑盒 50次 細胞內(nèi)核酸氧化8-氧鳥苷（8-oxo-G）流式細胞分析試劑盒 10次 細胞銅離子濃度比色法定量檢測試劑盒 20次
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